Charakteristika a zaměření pracoviště

Oddělení vzniklo při reorganizaci předchozího pracoviště zároveň s výměnou stávajícího vedení Oddělení lékařské genetiky a navazuje na tradici předchozích cytogenetických pracovišť. Svou dlouholetou tradicí, odborným, personálním a metodickým vybavením poskytuje komplexní služby při prenatální i postnatální diagnostice chromozomálních vad.

OLC rovněž působí jako školicí pracoviště v metodách kultivačních, cytogenetických a molekulárně cytogenetických včetně array CGH pro pre- i postgraduální výuku. Organizujeme stáže a nabízíme individuální školení v rámci předatestační přípravy v oboru Lékařská genetika.

Nabízené služby

• kultivace pro biochemická vyšetření
• kultivace pro molekulárně genetická vyšetření
• kultivace pro cytogenetická vyšetření
• kultivace pro molekulárně cytogenetická vyšetření
• cytogenetická vyšetření standardními metodami – vrozené a získané aberace
• molekulárně cytogenetická vyšetření
• vyšetření metodou array CGH
• kryoprezervaci

Mikrodeleční syndromy vyšetřované pomocí metody FISH (fluorescenční in situ hybridizace)

• všechny nejčastější mikrodeleční/duplikační syndromy
• aberace nalezené v různých unikátních nebo málo častých lokalizacích v genomu
• nové mikrodeleční syndromy objevené postupem „reverzní dysmorfologie“ arrayovými metodami

Další vyšetřované jednotky

• stanovení mozaicismu
• určení marker chromozomů
• delece regionu SRY na chromozomu Y
• vyšetření translokací pomocí paintingových sond a mnohobarevné FISH
• vyšetření dalších intrachromozomálních a subtelomerických oblastí

Array CGH pomocí oligonukleotidových čipů

• vyšetření pacientů s mentálním postižením, dysmorfologickými rysy a/nebo vrozenými vadami
• stanovení balancovanosti de novo aberací
• prenatální vyšetření plodů se zjištěnou vývojovou abnormalitou a normálním karyotypem

Podrobnější popis cytogenetických vyšetření prováděných v cytogenetické laboratoři:

Cytogenetická laboratoř se zabývá diagnostikou chorob podmíněných změnou počtu nebo struktury chromozómů. Tyto vady označujeme jako chromozomální aberace. Odchylky počtu nebo struktury chromozómů mohou způsobit :

• mentální nebo psychomotorickou retardaci
• poruchy vývoje centrální nervové soustavy
• kosterní anomálie, růstové poruchy
• deformity končetin a prstů včetně výskytu nadpočetných prstů
• poruchy reprodukce nebo úplnou sterilitu
• poruchy vývoje genitálu
• vrozené srdeční vady
• anomálie ledvin, trávicího traktu a dalších orgánů
• abnormální obličejové rysy - např. šikmé postavení, odchylky tvaru a rozestupu očí, rozštěp rtu, popř. patra, gotické patro, vznik ustupující brady, abnormální tvar a posazení ušních boltců
• poruchy nitroděložního vývoje plodu, spontánní potraty
• poruchy imunity
• zhoršení prognózy a extrémní zkrácení délky života
• dispozici k některým nádorovým onemocněním

Chromozomální aberace jsou zpravidla velmi závažnými změnami, které přímo nebo nepřímo ovlivňují větší počet genů. Geny se mohou vyskytnout ve více kopiích (zejména v případě změny počtu chromozómů), nebo mohou být naopak (v případě strukturálních aberací) deletovány, přerušeny, popř. fúzovány s jinými geny. Proto se u pacientů cytogenetické laboratoře většinou nevyskytuje jeden izolovaný defekt, ale mnohočetná postižení různých orgánových soustav. Z tohoto důvodu mají projevy chromozomálních vad charakter syndromů, tj. asociací různých typů postižení 

Chromozómy můžeme vyšetřovat v buňkách různých tkání. Nejjednodušší a nejčastější je kultivace lymfocytů získaných z periferní žilní krve. Ve tkáňové kultuře můžeme pro cytogenetické účely vypěstovat buňky získané biopsií kůže, svalu, ovarií, resp. dalších orgánů. 

Velký význam mají rovněž prenatální vyšetření, která se provádějí při podezření na chromozomální aberaci u plodu. Nejčastěji vyšetřujeme buňky plodové vody odebrané amniocentézou. Toto vyšetření se provádí zpravidla v 16.-18.týdnu těhotenství. Méně častá jsou vyšetření buněk placenty a pupečníkové krve, vzácně a v odůvodněných případech vyšetřujeme bioptický materiál z jiných tkání plodu. Různé fetální tkáně lze vyšetřit také ze sekčního materiálu potracených plodů pro dodatečné stanovení diagnózy, popř. objasnění příčiny spontánního potratu.

Zvláštním oborem je nádorová cytogenetika, též onkocytogenetika. V tomto případě se vyšetřují chromozómy z buněk kostní dřeně (u onemocnění krvetvorné řady ), popř. solidních nádorů (u jiných nádorových onemocnění). V chromozomální výbavě nádorových buněk jsou pozorovány výrazné změny oproti zdravým tkáním. U některých nádorových onemocnění je známa korelace mezi druhem chromozomální aberace a prognózou a cytogenetické vyšetření lze využít jako důležité diagnostické a prognostické kritérium.

Při odběru a během kultivace tkání je ve všech případech nutno dodržovat přísně sterilní podmínky a používat speciálně umyté nádoby a nástroje nebo sterilní pomůcky k jednorázovému použití (zkumavky, injekční stříkačky, špičky k pipetám apod.). Vzhledem k možné infekci (zejména virovými chorobami) musí pracovníci v cytogenetických laboratořích důsledně dodržovat příslušná pravidla bezpečnosti práce.

Výsledky chromozomálního vyšetření a jejich interpretace

Na obr.1 je znázorněn karyotyp lidské tělní buňky (lymfocytu periferní krve) v tzv. metafázi. V této fázi buněčného dělení jsou chromozomy nejlépe pozorovatelné a lze je dobře odlišit. Vizualizace chromozomů byla provedena tzv. G-pruhováním. Tato metoda se v klasické cytogenetice používá nejčastěji. Spočívá ve speciálním postupu, při němž jsou chromozómy vystaveny krátkodobému působení trypsinu a pak obarveny roztokem Giemsa-Romanowski. Vyhodnocení se provádí pod světelným mikroskopem s využitím imerzního objektivu.

Ke stanovení karyotypu se ve většině cytogenetických laboratoří používají počítače vybavené zvláštní kamerou připojenou k mikroskopu. Speciální počítačový program pak umožňuje rychlou analýzu mikroskopického obrazu a sestavení příslušného karyotypu. Podobným způsobem je možno vyšetřovat i chromozomy jiných organismů.

Normální lidský karyotyp (obr.1) je tvořen 46 chromozómy, tedy 23 páry chromozómů. Z nich 22 párů představují autozómy a jedním párem jsou zastoupeny tzv. pohlavní chromozómy neboli gonozómy. Ty se liší u obou pohlaví - u žen jsou přítomny dva chromozómy X, zatímco karyotyp muže obsahuje dva tvarově odlišné gonozómy - X a Y.

Z nápadného rozdílu v utváření chromozómů X a Y můžeme odvodit, proč existuje řada tzv. pohlavně vázaných chorob, které se manifestují u mužů, zatímco ženy jsou až na vzácné výjimky zdravými přenašečkami. Chromozóm Y je ve srovnání s chromozómem X daleko menší a obsahuje tedy také méně genů. Naprostá většina genů je přítomna pouze na chromozómu X. Pokud je některý z nich poškozen, nelze tuto vadu v mužských buňkách s konstitucí XY nijak kompenzovat.

V průběhu redukčního dělení, při němž vznikají pohlavní buňky ( vajíčka nebo spermie ), dochází k redukci dvojité sady chromozómů. Každá normální pohlavní buňka obsahuje poloviční počet chromozómů - u člověka 23.

Během tohoto dělení však může dojít k chybě při rozchodu některého páru chromozómů. Výsledkem této poruchy je vznik pohlavních buněk, u nichž některý chromozóm chybí nebo naopak přebývá. Tento proces je nejčastější příčinou odchylek v počtu chromozómů. Nejznámější z nich je Downův syndrom (podle charakteristického tvaru očních štěrbin dříve označovaný jako mongolismus), způsobený přítomností nadbytečného chromozómu 21. Pacienti s tímto syndromem mají tři chromozómy 21 místo dvou (obr. 2).

Obr. 2

Riziko chybného rozchodu chromozomů při vývoji vajíčka stoupá s věkem ženy, zvláště po 35. roce života. Proto je starším těhotným ženám navrhováno prenatální vyšetření. Většina plodů s abnormální sestavou chromozómů však již v prenatálním období vývoje umírá, a proto je nacházíme v materiálu ze spontánních abortů.

Příkladem onemocnění způsobeného chyběním chromozómu je Turnerův syndrom. Pacientkám s tímto syndromem chybí jeden chromozóm X, mají tedy pouze 45 chromozómů. Ženy postižené Turnerovým syndromem jsou většinou sterilní, mívají vrozenou srdeční vadu, nápadně malou postavu a nedokonale vyvinuté sekundární pohlavní znaky. Většina plodů s tímto chromozomálním nálezem se samovolně potratí (obr. 3).

Obr. 3

Druhou skupinou chromozomálních vad jsou změny jejich struktury. Vznikají jako důsledek dvou nebo více chromozomálních zlomů a následným chybným spojením poškozených chromozómů. Ty vznikají působením různých škodlivých látek - virů, chemikálií, záření. Pokud jsou pak poškozeny chromozómy v pohlavních buňkách, může se po oplodnění vyvíjet abnormální plod anebo se narodí postižené dítě. Zlomy chromozómů tělních buněk mohou vést k nádorovému onemocnění. Některé přestavby, tzv. vyvážené, nemusí nijak ovlivnit vzhled a inteligenci svého nositele, ale mohou se projevit v nevyvážené formě u dětí, resp. u potrácených plodů. Proto vyšetřujeme dospělé páry s opakovanými spontánními potraty.

Obr. 4

Na obrázku 4 je karyotyp nosiče vyvážené reciproké výměny genetického materiálu mezi chromozomy 1 a 19, která svého nosiče nijak nepoškozuje. Na obr. 5 je viditelná nebalancovaná translokace - nadbytečný materiál na chromozomu č.9.

Obr.5

Vyšetření chromozomových zlomů (získané aberace)

Provádí se u pacientů s tzv. syndromy chromozomální instability (autozomálně recesivní onemocnění, při kterém je snížena funkce mechanismů opravujících poškozenou DNA) jako pomocná diferenciálně diagnostická metoda, tj. výsledkem je pouze pravděpodobnost, že pacient je nosičem mutovaných genů. Další indikací je zvýšené množství klastogenních činitelů v pracovních, resp. životních podmínkách jedince (záření, metylační chemické látky, viry, onkologická léčba). Výsledek vyšetření odráží míru poškození DNA v buňkách; zvýšená hladina získaných aberací v periferních lymfocytech je spojena se zvýšeným rizikem chromozomálních aberací v jiných tělních buňkách, což může negativně ovlivnit zdravotní stav jedince a jeho reprodukci.
U některých syndromů chromozomální instability lze zvýšit průkaznost vyšetření indukováním ZCA in vitro metylačnímí látkami nebo ionizujícím zářením.

Některé změny jsou však běžným cytogenetickým vyšetřením zpravidla obtížně zjistitelné, proto je nutné využít citlivějších metod vycházejících z poznatků molekulární biologie - molekulární cytogenetiky.

Fluorescenční in situ hybridizace – FISH

představuje kombinaci metod cytogenetické a molekulární diagnostiky, proto je často užíváno označení „molekulární cytogenetika“. Technika v sobě zahrnuje denaturaci dvou DNA, jedné se známou sekvencí (sonda),  a druhé vyšetřované, avšak bez nutnosti izolace DNA ze vzorku vyšetřované tkáně. Hybridizujeme totiž sondu – obvykle DNA, jejíž lokalizaci v genomu známe – s chromozomy, buněčnými jádry či tkáňovými řezy přímo na preparátech.

Sondy se specificky vážou k přesně determinovaným úsekům genomu. Na obr. 6 je diagnostikován mikrodeleční Wiliams – Beuren syndrom, lokalizovaný na dlouhém rameni chromozomu 7, u pacienta s normálním karyotypem. Zelené signály detekují oba homologní chromozomy 7, zatímco absence jednoho červeného signálu prokazuje suspektní klinické podezření na submikroskopickou aberaci v dané lokalizaci genomu. K vyšetření lze použít i nedělící se buněčná jádra (horní část obrázku).

Obr.6

Metoda FISH má různé modifikace určené k identifikaci různých typů aberací. Obr. 7 znázorňuje výsledek využití mnohobarevné FISH při určení komplexní přestavby mezi 4 chromozomy.

Obr.7

Komparativní genomová hybridizace  - CGH

je metoda, při níž je na rozdíl od klasické FISH hybridizována vyšetřovaná DNA, izolovaná z jakékoli tkáně, s metafázními chromozomy normálního zdravého člověka. Kromě ní s týmiž chromozomy (na podložním skle) hybridizuje i DNA zdravého jedince. Obě DNA jsou značeny různými fluorophory a „soutěží“ o komplementární úseky chromozomů na podložním skle. Podle převažující intenzity  toho či onoho signálu zjišťujeme deleci či amplifikaci příslušné oblasti genomu. Vzájemný poměr obou fluorescenčních signálů hodnotí počítačový program, který současně umožňuje přesný popis rozsahu delece či amplifikace. Nevýhodou metody je nemožnost hodnocení reciprokých translokací, stejně jako určení lokalizace aberací v karyotypu.
K hodnocení submikroskopických aberací jsou vyvinuty metody  mnohem přesnější  array CGH. V tomto případě jsou cílová a normální DNA hybridizovány nikoliv s chromozomy, ale s velkým počtem malých úseků genomu, jež jsou ve formě teček navázány na podložní sklo, tzv. čip, na němž je každý úsek přesně lokalizován. Jeden čip může obsahovat DNA celého genomu, jednoho či několika chromozomů nebo jen část chromozomu navázanou různým způsobem, čímž je dána citlivost vyšetření. Výsledky hybridizace jsou snímány speciálním skenerem a hodnoceny počítačovým programem. Schéma metody viz obr.8.

Obr.8.: Testovaná a kontrolní DNA, každá označená jiným fluorochromem, jsou hybridizovány na podložní sklo s metafázními chromozomy (CGH) nebo na čip s úseky DNA (array CGH). Vyvážené oblasti se zobrazují kombinatorní barvou obou sond (žlutá), oblasti chybějící v testované tkáni – delece – barvou sondy referenční DNA (červená), lokusy zmnožené ve vzorku - duplikace – barvou sondy testované DNA (zelená)

Obr.8

Metoda, zhruba 100x citlivější než karyotypování, je na Oddělení lékařské cytogenetiky úspěšně využívána při diagnostice pacientů s mentálním postižením, vrozenými vývojovými vadami a obličejovou dysmorfií.

Obr.9: Delece (vlevo) a duplikace stejné oblasti chr.1 u dvou pacientů s mentální retardací.

Obr.9